Ready-Set-Go! サイトカイン ELISAセット使用方法
Ⅰ．セットの構成内容
1． Capture Antibody： コーティング用精製抗体 （力価測定済み）
2． Detection Antibody： ビオチン標識された検出用抗体（力価測定済み）
3． Standard Recombinaｎt Cytokine： 検量線用標準サイトカイン
4． Detection enzyme： Avidin Horse Radish Peroxidase検出酵素(Cat.No.18-4100)（力価測定済み）
5． Assay Diluent Solution： eBioscience ELISA Diluent Solution 5倍濃縮液(Cat.No.00-4202)
6． Coating Buffer： 10倍濃縮液
7． Substrate Solution： セット内にはTMB solutionが含まれています。
8． 96-well plate (Nunc Maxisorｂ flat-bottom, Nunc Cat. No. 442404)： （プレートを含む製品または試薬のみの製品もございます。）
9． Certificate of Analysis(試験成績書)： セットに入っているロットの抗体や標準溶液の希釈方法および標準曲線
Ⅱ．セット以外に必要なもの (セット内に含まれておりませんのでご準備下さい。)
1． Stop Solution： 1M H3PO4 あるいは2N H2SO4
2． Wash Buffer (PBS-Tween-20)*：
・1×PBS (NaCl 8.0 g、Na2HPO4 1.16 g、KH2PO4 0.2 g、KCl 0.2 gを1L の蒸留水に溶解 pH 7.0)
・0.05 ％ Tween-20
*注意：1×PBSにTween-20を0.05 %となるように加え、Wash Bufferとします。
Ⅲ．準備
1．Coating Buffer：蒸留水で10倍希釈し1×Coating Bufferとします。
2．Assay Diluent Solution：蒸留水で5倍希釈し1×Assay Diluent solutionとします。
Ⅳ．操作方法
(注意： 製品受領後は、直ちにStandard Recombinaｎt Cytokineを-80℃で凍結保存して下さい。 6ヶ月間保存可能です。)
1) Capture Antibodyを1×Coating BufferでCertificate of Analysis( C of A)の記載に従って希釈し、各ウェルを100μL/wellの抗体でコーティングします。プレートをシールし、4℃で一晩、インキュベートします。
(注意 ： * プレートは必ずNunc Maxisorb 96 well plateまたはCorning Costar9018を使用して下さい。 他のプレートを使用されますとCapture抗体の吸着が不十分な場合があり、データーの保証はできません。
* 10XのCoating Bufferは希釈前に室温に戻しておいて下さい。)
2) ウェルの液を吸引し、1ウェル当たり300μL以上のWash Bufferで3回洗浄します。その際プレートを逆さまにしてペーパータオルなどの吸収紙で、プレートの液を切ります。
3) ウェルに200μLの1×Assay Diluent Solutionを分注します。その後、プレートをシールし室温で1時間インキュベートしてブロッキングを行います。1×Assay Diluent Solutionは5 X 原液を4倍量の脱イオン水で希釈して調製します。
4) 2)と同様に吸引・洗浄を行います。
5) 標準曲線作成のためにStandard Recombinaｎt CytokineをC of Aに従い希釈し、倍々希釈*して各ウェルに100μLずつ分注し、試験サンプルを各ウェルに100μL加えます。その後、プレートをシールし室温で2時間インキュベートします。
*倍々希釈例：1000pg、500pg、250pg、125pg、62.5pg、31.25pg ・・・のように、希釈系列を作製して下さい。
6) 2）と同様に吸引・洗浄を行います。 今回は洗浄を5回行います。
7) Detection Antibodyを1×Assay Diluent SolutionでC of Aに記載されているように希釈し、Standard Recombinaｎt Cytokine及び試験サンプルの各ウェルに100μLずつ分注します。プレートをシールし、室温で1時間インキュベートします。
8) 2）と同様に吸引・洗浄を行います。今回も洗浄を5回行います。
9) Avidin-HRP検出酵素を1×Assay Diluent SolutionでC of Aに記載されているように希釈し、1ウェル当たり100μLずつ分注して、プレートをシールし、室温で30分間インキュベートします。
10) 2）と同様に吸引・洗浄を行います。この時はウェルにWash Bufferを満たし1～2分間放置した後、吸引除去します。今回は洗浄を7回行います。
11） 各ウェルに100μLのSubstrate Solutionを加え、室温で15分間インキュベートします。
12) 各ウェルに50μLのStop Solutionを加えます。
13) 450nmで吸光度を測定します。マイクロプレートリーダーで2波長測定可能な場合、570nmの吸光度をその値から引きます。