フローサイトメトリー解析
サンプル ： 全血 または PBMNC（Peripheral Blood MonoNuclear Cell, 末梢血単核球）
Ａ. 全血（Whole Blood, WB）
抗凝固剤 ： 0.1% EDTA-2K または3K塩（Caキレート剤） または
ヘパリン、クエン酸ソーダ（ACD）
赤血球溶解液 ： 0.83% NH4Cl溶液 室温で約10分間
Ｂ. PBMNC
・リンパ球分離溶液（Ficoll-Conray）を用いた比重遠心分離法で分離
・比重 1.077の分離液に血液を重層
・分離単核球を洗浄液で1〜2回遠心洗浄する
・抗体染色・洗浄液： 0.1%NaN3, 1%FCS添加PBS溶液
II．ヒト末梢血の抗体染色法
A. ヒト全血法
1． 抗体5ulをFalcon tubeに入れる。（型番末尾が-71, -73の製品は20ul）
2． 全血100ulを添加する。
3． 軽く攪拌する。 （Vortex Mixer等）
4． 室温、暗所で15分間抗体を反応させる。
5． 室温に戻した2mlの赤血球溶解液を加え、Vortexで攪拌後、室温、暗所で10分間保つ。
6． 300xgで、室温で5分間遠心する。
7． 上清を吸引除去する。
8． 2mlの抗体染色・洗浄液を加え、軽く攪拌する。
9． 300xgで、室温で5分間遠心する。
10. 上清を吸引除去する。
11．0.3mlの抗体染色・洗浄液を加え、ナイロンメッシュ（100メッシュ/inch程度）で濾過した後、フローサイトメーターで測定する。
(保存は4℃（冷蔵庫内）または氷中で行う。)
B. ヒトリンパ球分離法（単核球法）
1. リンパ球分離溶液を用いて比重遠心法で単核球を分離する。
2. 抗体染色・洗浄液で2回、遠心洗浄し、1 x 107 cells/mlに懸濁させた単核球浮遊液を調製する。
3. 抗体5ulをFalcon tubeに入れる。（型番末尾が-71, -73の製品は20ul）
4. 1 x 107 cells/mlの単核球浮遊液を、100ul添加する。(106 cells/tube)
5. 軽く攪拌する。 （Vortex Mixer等）
6. 4℃、暗所で20分間抗体を反応させる。 氷中では25〜30分間
7. 約2mlの抗体染色・洗浄液を加え300xgで、4℃で5分間遠心する。
8. 上清を吸引除去する。
9. 約2mlの抗体染色・洗浄液を加え軽く攪拌後、300xgで、4℃で5分間遠心する。
10． 上清を吸引除去する。
11． 0.5mlの抗体染色・洗浄液を加え、ナイロンメッシュ（100メッシュ/inch程度）で濾過した後、フローサイトメーターで測定する。
（ 保存は4℃（冷蔵庫内）または氷中で行う。）
III． マウスリンパ球の抗体染色
1． 脾臓や胸腺よりリンパ球を取り出す。
2．抗体染色・洗浄液で2回、遠心洗浄し、1 x 107 cells/mlに懸濁させた細胞浮遊液を調製する。
3． テストチューブに1 x 107 cells/mlの単核球浮遊液を100ul分注する。
(106 cells/tube)
4．抗体（0.25ug〜１ug）を添加する。
5． 軽く攪拌する。 （Vortex Mixer等）
6． 4℃、暗所で20分間抗体を反応させる。 氷中では20〜30分間。
7．約2mlの抗体染色・洗浄液を加え300xgで、4℃で5分間遠心する。
8．上清を吸引除去する。
9．2mlの抗体染色・洗浄液を加え軽く攪拌後、300xgで、4℃で5分間遠心する。
10．上清を吸引除去する。
11．0.5mlの抗体染色・洗浄液を加え、ナイロンメッシュ（100メッシュ/inch程度）で濾過した後、フローサイトメーターで測定する。
（保存は4℃（冷蔵庫内）または氷中で行う。）
抗体染色の種類
1． 直接法
蛍光標識抗体を用い、１段階で染色
・フローサイトメトリでは検出感度が高いため、蛍光標識抗体があればこの方法で染色することが多い。
・特にマルチカラー染色を行う時はこの方法を用いる。
2． 間接法
精製抗体 ＋ 蛍光標識抗マウス（ラット）抗体
・検出感度が高くなるため免疫組織染色で使用することが多い。
・抗原量が少なくて検出しにくい時はフローサイトメトリでも利用する。
・または蛍光標識抗体が無い時はこの方法に依らざるを得ない。
3． ビオチン・アビジン法
ビオチン標識抗体 ＋ 蛍光標識アビジン（ストレプトアビジン）
・検出感度が高くなるため免疫組織染色で使用することが多い。
・抗原量が少なくて検出しにくい時はフローサイトメトリでも利用する。
アビジン ： 卵白中の蛋白質でビオチンと高い結合力を有する。
ストレプトアビジン ： 放線菌が作るアビジン様蛋白で、非特異的反応が少ない。