mouse TrueBlot^TMとrabbit TrueBlot^TM を従来のHRPOブロッティング試薬と置き換えるだけで発表・投稿用のきれいなデータを容易に作製することが出来ます。

TrueBlot^TM は目的な蛋白のバンドを他のコンタミバンドに妨げられることなく検出するHRPO標識イムノブロッティング用検出試薬です。　TrueBlot^TM はmouse IgG やRabbit IgG-のdisulfide型のみを検出し、免疫沈降操作によって生じる〜55kDaや〜23kDaのIgGの軽鎖はほとんど 検出しないので免疫沈降後のイムノブロッティングに理想的な試薬です。

この試薬はリン酸化やアセチル化などの蛋白の修飾や蛋白間の相互作用を研究するのに有用です。

Jurkat細胞抽出液からrabbit IgG 抗ヒトStat1抗体を用いて免疫沈降したStat1を電気泳動にかけ、 膜に転写後、rabbit anti-Stat1でimmunoblotし、Rabbit IgG TrueBlot^TMま たは従来のHRP anti-Rabbit IgG 2次試薬で検出しました。

後者（右図）では還元/変性したIgGのL鎖やH鎖がコンタミしていますが、前者、Rabbit IgG TrueBlot^TM、 （左図）ではStat１のバンドのみが検出されました。　

実験例（Rabbit TrueBlot^TM）

Rabbit IgG TrueBlot^TMで最適の結果を得るには免疫沈降の1次抗体を沈降さ せるのにProtein AやProtein G Beadsを用いるよりもAnti-Rabbit IgG IP　Beads(cat#00-8800-25)を使用する必要があります。

免 疫沈降した蛋白を分離させる時にProtein A やProtein Gがビーズから切れてコンタミしてきます。そしてImmunoblotting のゲル電気泳動でProtein Aは40-60kDa、Protein Gは25-30kDaに泳動され1次抗体を反応させると1次抗体のrabbit IgGがProtein AやProtein Gに結合しTrueBlot^TMを 加えた時にバンドとして検出されてしまいます。Mouse IgGはProtein AやGへの結合性が弱いのでこれらのバンドは検出されません。

図２はJurkat細胞溶解液（1 x 10⁷ cells/mlの 0.5ul）をrabbit anti-human Stat 1と反応後、Protein G、Protein AやAnti-Rabbit Ig IP Beadsで沈降させ、5 x 10⁵ cellsからの沈降物がrabbit anti-Stat 1とRabbit IgG TrueBlot^TMの系でImmunoblotされた時の結果です。

図３は図２と同様に0.5ulの1 x 10⁷ cells/ml のJurkat細胞から3ugのrabbit anti-human Stat 1でStat 1を免疫沈降し、電気泳動後Immobilon membraneに転写し、HRP-anti- rabbit IgGで検出した図です。

Lane 1(検体10ul) とLane 2(30ul)はRabbit IgG TrueBlot^TMで検出したもので、Heavy chainとLight chainは検出されません。

Lane 3と４はLane 1と2を通常のHRP-anti-Rabbit polyclonal antibodyで再ブロットしたものでHeavy chainとLight chainが検出されました。

Stat 1を5ｘ10⁶ 個のJurkat細胞から3 ugのrabbit anti-Stat 1 (Lab Vision)と50ulの anti-Rabbit Ig IP Beads(packed,cat#00-8800-25)を用いて免疫沈降しました。　

沈 降物をNuPAGE sample reducing agent(dithiothreitol;Invitrogen cat# NP0004)を含む100ulのNuPAGE LD sample buffer(Invitrogen, cat# NP0007)に溶解しビーズを遠心後、5ｘ10⁵個 のJurkat細胞からの沈降物と0.3ugの沈降用抗体に相当する10ul（Lane１）と１.5ｘ10⁶個のJurkat細胞からの沈降物と0.9ugの沈降 用抗体に相当する30ul(Lane 2)を4-12%ミニゲル（Invitrogen）に泳動し、Immobilon-P membrane(Millipore)に転写します。

メ ンブレンをBuffer A(0.3M Tris,pH7.3, 0.15M NaCl, 0.1% Tween-20)に溶解した5％低脂肪ドライミルクで4℃で終夜ブロックしました。Stat 1を5％ミルクを含むBuffer Aに2ug/mlの濃度に添加した抗Stat 1抗体で室温で2時間、immunoblotします。ついでBuffer Aで洗浄後、メンブレンを5％ミルクを含むBuffer Aで1,000倍希釈したRabbit IgG TrueBlot^TMで室温で１時間インキュベートしました。メンブレン をBuffer Aで洗浄し、ECL reagent(Amersham)で発色し、フィルムに感光させました。

実験例（Mouse TrueBlot^TM）

Caspase-7を5x10⁶個 のJurkat cellsから5ugのマウス抗caspase-7抗体（Cat.No.14-9967)と50ulのprotein-G beads(Amersham)用いて免疫沈降します。

免 疫沈降物をNuPAGE sample reducing agent(dithiothreitol)(Invitrogen)を含む100ulのNuPAGE LDS sample buffer (Invitrogen)に溶解し、ビーズを遠心除去後、その10ulを4-12%ミニゲル（Invitrogen）に泳動し、Immobilon-P membrane(Millipore)に転写します。

メンブレンをBuffer A(0.3M Tris,pH7.3, 0.15M NaCl, 0.1% Tween-20)に溶解した5％低脂肪ドライミルクで室温で１時間ブロックします。

Caspase -7を2％ミルクを含むBuffer Aに2ug/mlの濃度に添加した抗Caspase-7抗体で室温で2時間、immunoblotします。ついでBuffer Aで洗浄後、メンブレンを2％ミルクを含むBuffer Aで1,000倍希釈したMouse IgG TrueBlot^TMで室温で１時間インキュベートします。

メンブレンをBuffer Aで洗浄し、ECL reagent(Amersham)で発色し、フィルムに感光させます。

図１：　Caspase-7は1 x 10⁷ cells/mlのJurkat細胞の0.5mlから5ugの抗ヒト Caspase-７抗体で免疫沈降されました。

1 x 10⁶ cellsからの沈降物が電気泳動にかけられ、Immobilon membraneに転写後、抗Caspase-7抗体、次いで従来のHRP標識抗マウスポリクローナル抗体やMouseIgG TrueBlot^TMでimmunoblotされました。

• Lane 1:従来のHRP標識抗マウス抗体で検出；免疫沈降用の抗Caspase-7抗体のheavy chainとlight chainも検出されます。
• Lane 2: Mouse IgG TrueBlot^TMで検出；heavy chainとlight chainは検出されません。
• Lane 3: Lane 2を従来のHRP標識抗マウス抗体で再ブロット；heavy chainとlight chain は検出されます。

電気泳動後、膜にブロットしTrueBlot^TMと 従来のHRPO標識抗マウスIgGで検出すると、True BlotTMではcaspase-7のみが検出され、Ig heavy chains（55kD） や light chains（23kD）のバンドは検出されませんが（Lane 2）、従来のHRPO標識抗マウスIgGではLane１に示されるようにcaspase-７に加えてIgのheavy chain とlight chainが検出されました。

Lane 3はLane 2を従来のHRPO標識抗マウスIgGで再ブロットしたものでIgの両バンドが検出されます。