Q；どのような抗体を提供していますか？

• 弊社ではマウス、ヒト、ラットのCDと他の表面抗原およびサイトカインとケモカイン、アポトーシス関連抗原に対する モノクローナル抗体とポリクローナル抗体を提供しています。

Q；どのような形状の抗体がありますか？

• 使用しやすいように、多種類の形状の抗体を提供しています。アジ化ナトリウムを含む精製抗体と含まない精製抗体、ビ オチンやFITCやPEのような蛍光色素を標識した抗体などです。

Q；アジ化ナトリウムを含まない製品はありますか？

• はい。弊社ではFG（Functional Grade）精製抗体がアジ化ナトリウムを含まない抗体で、バイオアッセイやin vivoの研究に用いることができます。

Q；精製抗体とFG精製抗体の違いは何ですか？

• 抗 体クローンの精製抗体はサンプルの無菌状態を保つためにアジ化ナトリウムを含んでいます。この抗体はウェスタンブロット、免疫沈降、免疫組織染色、フロー サイトメトリーに用いることができます。FG精製抗体はアジ化ナトリウムのような防腐剤を含まず、バイオアッセイやin vivoの研究に有用です。FG精製抗体は無菌のテストとエンドトキシン濃度が0.01ng /g 以下（社内標準値）であることを確認しています。しばしば、エンドトキシンレベルが標準値より低い時があります。これは製品に防腐剤を含まず、無菌状態を 保つため適切な測定が必要であるためです。

Q；抗体の濃度は？ 

　　　　※テストサイズの製品につきましてはデータシートをご参照ください。

Q；製品の用途は？

• フローサイトメトリーによる表面抗原の解析
  フローサイトメトリーによる細胞内抗原の解析
  免疫組織染色
  イムノブロッティング（ウェスタンブロット）
  免疫沈降
  ELISA
  ELISPOT
  マウスにおけるin vivo研究
  バイオアッセイ
  ブロッキング、中和アッセイ
  

Q；注文はテスト単位ですか、マイクログラム単位ですか？

• ほ とんどの製品はグラムですが、一部の製品はテストで提供しています。テストで製品を購入された場合、フローサイトメトリーにおける適切な濃度を提供致しま す。従ってその濃度ですぐ使用できます。グラムでのご購入の場合は、弊社では希釈データは取りません。ご使用に合わせて適切な濃度に希釈してください。種 々の用途に種々の濃度でご使用頂けます。

Q；抗体の交差反応の情報はありますか？

• 抗 体のデータシートに記載してあります。他種における同属抗原を持つ抗体の交差反応を確認するには抗体のアイソタイプを見ると良いでしょう。アイソタイプは 抗体の起源が示されています。抗ラット抗体のアイソタイプがマウスであるならば、マウスの細胞には反応しません。一般的に抗体は、抗体を作製した種の抗原 を認識しないからです。ヒトのCD抗体の霊長類に対する反応性はeBioscience社のhome pageをご覧ください。

Q；FG精製抗体のエンドトキシン濃度は？

• FG精製抗体は無菌のテストとエンドトキシン濃度が0.01ng /g以下（社内標準値）であることを確認しています。しばしば、エンドトキシンレベルが標準値より、より低い時があります。もし必要であれば、エンドトキ シン濃度をご提供致します。

Q；Avidin-Hors Radish Peroxidase (AV-HRP: Cat#18-4100) の濃度は？

• AV-HRP (Cat#18-4100)
  濃度は、約1.25mg/ml
  通常使用する時は、1/500 〜 1/1000 に希釈してご使用下さい。

Q；リコンビナントの濃度と特異活性 units/mlは？

• Bioassay protocolのprotein chartをご参照ください。いくつかのタンパクは凍結乾燥で提供していますので、バッファーで戻す必要があります。方法は製品に添付されてきますので、 必ず従ってください。

Q；特定のタンパク(サイトカイン)をELISAで測定するにはどのような組み合わせが良いでしょ う？

• ELISA protocolのAntibody Pairsのチャートをご参照ください。このチャートにはヒトとマウスのサイトカインが記載されており、capture用抗体と検出用抗体がリストされて います。さらに抗体の組み合わせとリコンビナントタンパクのスタンダードについてはカタログまたはeBioscienceのhome pageでご参照ください。

Q；ELISA用抗体はELISPOTにも用いることができますか？

• ELISAで用いられる抗体の組み合わせは、ELISPOTにも用いることができます。ELISPOT Best ProtocolとELISPOTに使用できる抗体の組み合わせのリストをご参照ください。

Q；Ready-SET-Goキットのリコンビナントサイトカインの濃度は？

• そ れぞれのReady-SET-GoキットにはCertificate of Analysis(C of A),分析証明書が添付されています。分析証明書の方法は使用に適しています。もし分析証明書を紛失し必要とされる時は、lotナンバーを伺いお送り致し ます。リコンビナントサイトカインの標準曲線の最高濃度はReady-SET-Go BestProtocolのページにも記載されています。

Q；Single-Use ELISA RSG Standard(4 pack)の濃度、容量は？

• 濃度　1ug/ml
• 容量  20ul x 4本

Q；Ready-SET-Goキットのプレートには抗体がpre-coatされていますか？

• いいえ。コーティングの方法は分析証明書に記載されています。

Q；細胞内染色の特異的なテストはどんなものですか？

• 染色の特異性を確認するには、標識していない抗体で直接標識サイトカイン抗体をブロックすることです。リコンビナン トサイトカインでもブロックできます。

Q；Monensin とBrefeldinAは何をしますか？

• Monensin とBrefeldin Aはゴルジ体による細胞からのサイトカインの分泌を阻止する輸送阻止物質です。従って細胞内のサイトカインの濃度を上げます。細胞内染色をする前に、この 2つの試薬でインキュベーションし、細胞内にサイトカインを蓄積させます。これらは細胞内サイトカインの検出に不可欠な試薬でかなり希釈して使用します。 詳しくはデータシートをご参照ください。

Q；Ready-SET-Goキットの感度はどうですか？

• ヒトとマウスのリコンビナントサイトカイン感度はReady-SET-Go BestProtocolをご参照ください。

Q；Ready-SET-Goキットには何が入っていますか？

• capture用抗体、検出用抗体、サイトカイン　スタンダード、検出用酵素、コーティング　バッファー、希釈溶 液、基質溶液が入っています。

Q；Ready-SET-Goキットは血清サイトカインも検出できますか？

• それぞれのReady-SET-Goキットは血漿、血清、培養上清のサイトカインを検出できます。

Q；Ready-SET-Goキットはラットのサイトカインと交差しますか？

• 確認していません。現在ラットサイトカインのELISAキットのパネルを作製しています。

Q；どのような蛍光色素を提供していますか？

• FITC, PE, PE-Cy5, PE-Cy5.5, PE-Cy7, APC, PerCP-Cy5.5, Cy5, eFluor™ 605NC, eFluor™ 625NC, eFluor™ 650NC, eFluor™ 450, APC-eFluor™ 780, Pacific Blue®, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 700, APC-Alexa Fluor® 750 標識の抗体を提供しています。

Q；蛍光色素標識抗体はフローサイトリー以外の用途にも使用出来ますか？

• 蛍光色素標識抗体はフローサイトリー用に開発しています。蛍光顕微鏡観察などの他の用途に利用する時はそれぞれの用 途への蛍光色素の適用性を評価する必要があります。

Q；フローサイトメトリーで特定の細胞を染色するにはどのような抗体を使用すれば良いでしょうか？

• 目的の細胞にのみ発現している抗原を調べるにはフローサイトメトリーページのBestPhenotyping Quick Guideをご覧下さい。そこでその抗原を認識する適切な抗体を見たり、個々の抗体の製品情報にリンクすることが出来ます。

Q；フローサイトメトリーでは生細胞と死細胞をどのように識別しますか？

• 生 細胞と死細胞の識別は7-Aminoactinomycin D(7-AAD, 製品番号00-6993)を用いて行います。フローサイトメーターで測定する前に100万個の細胞に５μlの色素溶液を加え5分間インキュベートします。 7-AADは死細胞の細胞膜を透過し核に結合して染色します。生細胞の核酸は色素が透過しないので染色されません。データを解析する時に色素で染色された 死細胞をゲートからはずします。

Q；Cychrome標識抗体はありますか？

• はい、CychromeはR-Phycoerythrin/Cy5 タンデム色素のPharMingen社製品名で、eBioscience社が単にPE-Cy5と呼んでいる色素と同じです。

Q；フローサイトメトリーでマルチカラー染色に適当な蛍光色素にはどんなものがありますか？

• PE とFITCが488nmのレーザー光で一般に使用される色素です。PE-Cy5タンデム色素は488nmで励起され、PEやFITCとは蛍光波長の異なっ た明るい色素で、シングルレーザーで3カラー解析を行うのに適しています。さらにAPCやAPC-Cy7, PE-Cy7色素等を用いてマルチカラー解析を行います。これらの色素の分子量や励起、蛍光波長の詳細はBest ProtocolsのFluorescent Dyes Chartをご参照ください。または標識抗体の用途に関するオンラインカタログ情報をご参照ください。

Q；Compensation(蛍光補正)とはどういうものですか？

• Compensation とは２種類以上の抗原を染色する時に蛍光色素の間で起る蛍光波長の重なりを補正する技術です。　例えばFITCはPEのチャンネルによって検出される波長 でも蛍光を発します。　その結果、偽のPE染色細胞と判定されてしまいます。　そこで正しく染色細胞を検出するため適切な蛍光補正を行なわなければなりま せん。Compensationに関する詳細はhttp://www.drmr.com/をご参照ください。

Q；マウスにin vivoで使用できる精製抗体はありますか？

• ア ジ化ソーダのような防腐剤を含んでいないFunctional Grade(FG)の抗体がバイオアッセイやin vivoの実験に使用出来ます。　さらにこれらの抗体は無菌性と0.01ng以下/μg抗体）の低endotoxin含量が確認してあります。 endotoxin含量は防腐剤がない抗体の無菌性を維持するために時々この基準以下であることがあります。

Q；精製抗体とFG精製抗体の違いは何ですか？

• 精 製抗体はサンプルの無菌状態を保つためアジ化ナトリウムを含んでいます。ウェスタンブロット、免疫沈降、免疫組織染色、フローサイトメトリーに用いる事が できます。FG精製抗体はアジ化ナトリウムのような防腐剤を含まず、バイオアッセイやin vivoの研究に使用できます。これらは無菌の状態をテストし、0.01ngエンドトキシン/g抗体に合うものです。0.01ng/g以下になる事もあり ますが、これは防腐剤を含まず無菌状態で測定を行なわなければならないからです。

Q；in vivo実験で抗体を投与する量と方法はどうでしょうか？

• in vivo使用に関するBestProtocolページにin vivo実験に使用された抗体と使用した文献のリストがあります。
  http://www.ebioscience.com/ebioscience/bestprotocols.asp

Q；免疫組織染色にeBioscience社の抗体を使用することが出来ますか？

• その抗体の使用が文献に報告されていたら製品のTechnical Data Sheetに記載されています。　弊社では選択した製品について凍結組織を用いた免疫組織染色や免疫沈降、イムノブロッティングを行い品質を管理していま す。

Q；それらの抗体はホルマリン固定パラフィン包埋マウス組織を染色することが出来ますか？

• それらの検体では報告が少ないのでテストしていません。

Q；免疫沈降に使用することが出来ますか？

• その抗体の免疫沈降への使用が報告されていたら製品のTechnical Data Sheetに記載されています。　弊社では選択した製品について凍結組織を用いた免疫組織染色や免疫沈降、イムノブロッティングを行い品質を管理していま す。

Q；ウェスタンブロッティングに使用することが出来ますか？

• その抗体のウェスタンブロッティングへの使用が報告されていたら製品のTechnical Data Sheetに記載されています。弊社では選択した製品について凍結組織を用いた免疫組織染色や免疫沈降、イムノブロッティングを行い品質を管理していま す。

1. Q；どのようなTLR抗体がありますか？

• ヒトTLR1, 2, 3, 4, 9, 10, CD180/RP105, MD-2, MyD88やマウスTLR2, 4/MD-2, 6, 9, CD180/RP105, MD-1, MD-2, MyD88 に対する抗体があり、形状も精製抗体, FG精製抗体, FITC, PE, biotin標識など各種の抗体があります。下記にて、TLR Product Listingをご参照ください。
  
  http://www.ebioscience.com/ebioscience/whatsnew/tlr.htm

2. Q；それらの抗体はin vitroでのBlockingに使用出来ますか？

• 抗ヒトTLR2（clone TL2.1）, 抗ヒトTLR3（clone TL3.7）, 抗ヒトTLR4 （clone HTA125）や抗マウスTLR4/MD-2(MTS510)がサイトカインの分泌を中和すると報告されています。抗ヒトTLR１(clone GD2.F4)や抗マウスTLR2（clone 6C2）もまだ報告はされていませんが中和実験に使用されています。TLRは種々の細胞に種々の程度に発現され、細胞の活性化の状態が発現の調節に役割を 果たしているようなので、先ず実際のアッセイ条件で抗体の中和反応を調べられることをお奨めします。TLR2やTLR4では特異的なリガンドで刺激された ヒト末梢血のサイトカイン産生が約30-50％阻害されます。しかしアッセイ培地や試薬中に他の微生物産物による刺激があったり、培地だけで自然に高濃度 のサイトカイン産生が起る状態では抗体による阻害が起りにくいです。

3. Q；抗TLR抗体によるin vitro中和実験のプロトコールはありますか？

• 中和実験のプロトコールを記載した文献は各抗体のデータシートに記載されています。さらに可能なら社内でその実験を 追試し、その プロトコールと結果をweb上に載せています。　このプロトコールは一般的なガイドラインとして有用ですが、先ず実際のアッセイ系で中和反応を評価される ことをお奨めします。下記をご参照ください。
  
  TLR4 neutralization protocol: http://www.ebioscience.com/ebioscience/appls/NUtlr4.htm
  TLR2 neutralization protocol: http://www.ebioscience.com/ebioscience/appls/NUtlr2.htm

4. Q；FG精製抗体はどういう抗体ですか？

• Functional Gradeの精製抗体とはアジ化ソーダなどの防腐剤を含まず、無菌的で低endotoxin含量の抗体です。TLRを用いたin vitroの実験にはFG精製抗体の使用をお奨めします。

5. Q；ヒトやマウスのTLRの発現型はどのようなものですか？

• TLRの研究は新しくその発現型は主にmRNAレベルで研究されてきました。それらのデータは下記に記載されている 文献に報告されています。
  
  http://www.ebioscience.com/ebioscience/whatsnew/tlr.htm.
  
  特異的な抗体が開発され有用になり情報が蓄積されればmRNAとProteinレベルでの発現の相関性が解明されるでしょう。モノクローナル抗体を用いた 研究ではヒトTLR1, TLR2, TLR4やマウスTLR4/MD-2, TLR2の発現が（あるファミリーでは非常に低濃度であるが）骨髄系の細胞表面に確認され、内皮細胞や上皮細胞などの他の細胞におけるTLR2やTLR4 の発現と活性化による増強も報告されています。これまでの結果ではヒトのTLR3やTLR9はほとんど細胞内に発現しています。ヒトのTLR3はmRNA レベルで樹状細胞のみに限られた発現が報告されていましたが、新しく開発されたTLR3抗体（clone TLR3.7）を用いてヒトの線維芽細胞株で細胞内の発現が検出されました。　ヒトのTLR9の細胞内発現は健常者の末梢血リンパ球では検出されませんで したが、in vitro誘導樹状細胞では抗ヒトTLR9（clone eB72-1665）抗体を用いて検出されました。　

6. Q；どうして抗TLR4抗体を用いた染色が非常に暗かったり、陰性であったりするのでしょうか？

• TLRの中でもTLR4はヒト末梢血単球やチオグリコレート刺激マウス腹腔細胞などの骨髄系細胞の表面に非常に低レ ベルで発現し ています。作用を調べた実験から分かるようにTLR4の細胞表面上の発現はそのように低いですが、そのリガンドのLPSを認識し、非常に良く反応し、優れ たシグナル伝達系だと考えられます。TLR4の最適な検出にはPE標識抗体の使用をお奨めします。またマウス腹腔細胞の染色にはFcRによる抗体の結合を ブロックするため抗マウスCD16/CD32抗体の添加をお奨めします。測定する細胞やアイソタイプコントロールが強いシグナルを示すときはTLR4の弱 い発現が隠されて検出できないことがあります。

7. Q；TLR抗体は免疫組織染色にも使用出来ますか？私達はTLRの発現と作用を調べるために幾つかの細胞株を使用していますが、抗体染色の陽性細胞として どのような細胞や組織を用いれば良いでしょうか？

• TLR抗体の陽性対照細胞としてはヒトの末梢血の単球が最も良いです。健常者の溶血した全血を抗TLR1, TLR2, TLR4で染色し、FSC/SSC画面で単球集団にゲートを設定すれば最も良く検出されます。上に述べたようにTLR4は非常に低レベルで発現しているの で普通バックグランドの1/4〜1/3 logだけしかシフトが見られません。また報告によればTLR１の発現には個体差が大きいようです。TLR2は骨髄系細胞の表面に容易に検出されます。 フローサイトメトリーデータに関しては抗体のデータシートをご参照ください。抗マウスTLR4/MD-2抗体の陽性対照としてはチオグリコレート刺激マウ ス腹腔細胞が最も適しています。上に述べたようにTLR4は非常に低レベルで発現しているので普通バックグランドの1/4〜1/3 logだけしかシフトが見られません。　ヒトTLR2と同様に、マウスTLR2は脾臓マクロファージ（Mac-1+ cell）やチオグリコレート刺激マウス腹腔細胞に容易に検出されます。フローサイトメトリーによるTLRの検出法の詳細に関しては、下記のURLにて Detection of TLRs by Flowcytometryをご参照ください。
  
  http://www.ebioscience.com/ebioscience/appls/TLR_FC.htm

8. Q；TLR抗体は免疫組織染色にも使用出来ますか？

• これらの抗体のあるものはヒトやマウスの凍結組織を用いた免疫組織染色への適用が報告されています。しかしこれらの TLRの発現は少ないので免疫組織染色はあまり有用ではありません。適用性に関してはデータシートをご参照ください。

9. Q；TLR抗体はimmunoblottingに使用できますか？

• 抗ヒトTLR1（clone GD2.F4）, 抗ヒトTLR4(clone HTA125)や抗マウスTLR4/MD-2（clone MTS510）をimmunoblotting（ウェスタンブロッティング）に用いた報告はありませんが、抗ヒトTLR2(clone TL2.1)は１報あります。トランスフェクタントの細胞抽出液が非常に高レベルのTLR2を発現している時はこのヒトTLR2抗体はきれいなシグナルを 生じます。　　

10. Q；抗TLR抗体はどのようなエピトープを認識しますか？

• 私達が提供するTLRファミリーのモノクローナル抗体のほとんどは全長の融合蛋白やトランスフェクタントから作製し ているので、 認識するエピトープのアミノ酸配列は分かっていません。 中和活性を示す抗体ではこのリセプターへリガンドが結合する部位近傍や結合を阻害する部位にエピトープがあると推測されます。

11. Q；これらの抗体はラットやヒト以外の霊長類、ウシなどの他の動物のTLRと交差反応しますか？

• ラット腹腔浸出細胞を用いた予備的なフローサイトメトリー解析ではこれらのマウス抗ヒトTLR抗体はラットのTLR とは交差反応 しません。　また抗ヒトTLR4抗体はアカゲサル（Rhesus）、カニクイザル（Cynomolgus）やヒヒ（Baboon）と交差反応を示しません でした。　私達は文献や研究者から交差反応性に関する情報を集めています。

12. Q；抗マウスTLR4/MD-2や抗マウスTLR2はin vivoの実験に使用出来ますか？

• 現在のところin vivoの実験に使用した報告はありません。

13. Q；Webに記載されていない標識抗体がほしいのですが、どうしたら良いでしょうか？

• eBioscience社は蛋白に蛍光色素等を標識する技術と経験を有しています。弊社または弊社代理店を通じてご 連絡ください。出来るだけ早くご要望の標識体を提供できるよう努力いたします。

14. Q；多量の抗体を研究用にほしいのですが、どうしたら良いでしょうか？

• 弊社または弊社代理店を通じてご連絡ください。出来るだけ早くご要望の品を提供できるよう努力いたします。